《第十二夜》寫于1601年，此時莎士比亞的藝術成就已經進入了一個成熟時期，并且將邁入他的悲劇創作時代，此劇是莎士比亞創作的最后一部喜劇，也是喜劇藝術的巔峰之作。此劇被成為莎士比亞喜劇作品中最令人快樂的一部。

劇中巴斯辛和薇奧拉是相貌相同的孿生兄妹。在一次航海事故中，兩人在伊利里亞岸邊失散。薇奧拉以為哥哥身遭不幸，便女扮男裝，化名西薩里奧，投到當地奧西諾公爵的門下當侍童。奧西諾公爵派薇奧拉替他向年輕貌美而富有的伯爵小姐奧麗維婭求婚。可是，這時薇奧拉已經暗暗地愛上了主人奧西諾。而奧麗維婭卻對代主求婚的薇奧拉一見鐘情。事情變得微妙復雜了。

與此同時，一個密謀正在奧麗維婭家中進行。她的叔父托比等人由于受到傲慢的大管家馬伏里奧的斥責，便對他進行報復。他們模仿奧麗維婭的筆跡寫了一封情書給馬，信中鼓勵馬大膽求愛，并要他經常穿著令人厭惡的黃色長襪。馬伏里奧鬼迷心竅，上了他們的當，丑態百出；而奧麗維婭則以為管家在發瘋。

為贏得奧麗維婭的芳心，奧西諾再次派薇奧拉到奧麗維婭的家中游說。奧麗維婭愈加愛慕薇奧拉了。而奧麗維婭的叔父卻執意要將她嫁給蠢笨的富戶安德魯，于是便與奧麗維婭的女仆瑪莉婭一起極力鼓動安德魯和薇奧拉決斗。

原來薇奧拉的哥哥西巴斯辛遇難時被海盜船長安東尼奧所救，倆人結成莫逆之交。來到伊利里亞后，由于安東尼奧船長懼怕伊利里亞當局的追捕，不能陪西巴斯辛逛城，便把錢袋交給他使用。

安東尼奧船長意外地碰到正在和安德魯決斗的薇奧拉，他錯把她當成她的哥哥西巴斯辛，遂上前拔刀相助。然而，路過此地的警察認出了他并把他逮捕。安東尼奧看到薇奧拉對自己被捕既無動于衷，也不肯還他錢袋，大為吃驚，遂指責她忘恩負義。安德魯等人還想找薇奧拉決斗，但是他們遇到了西巴斯辛，錯把他當成薇奧拉，便拔劍相向，幸被及時趕來的奧麗維婭所制止。奧麗維婭也錯把西巴斯辛當成薇奧拉，并把他請到家里表示愛情，倆人遂私下結百年之好。

馬伏里奧被宣布患有精神錯亂而關進了暗室，并被裝扮成牧師的小丑百般戲弄。后來馬伏里奧得機寫信向奧麗維婭小姐申辯，才使得真相大白。

最后，西巴斯辛和薇奧拉兄妹重逢，西巴斯辛和奧麗維婭相愛，奧西諾公爵被薇奧拉的品貌所感動，宣布娶她為妻，安東尼奧船長亦獲自由。除馬伏里奧外，眾人皆大歡喜。

  《第十二夜》得名于西方傳統節日，1月5日的主顯節前夕是基督教節日的一個分支，那一天晚上是基督教十二天圣誕假期中的最后一夜即第十二夜，之后就是圣誕節后第十二日，也就是1月6日的主顯節，又稱第十二日節在這一天，教堂里不僅要照例舉行儀式，在宮廷里和貴族家里也常常演劇慶祝，莎士比亞此劇顯然是為慶祝這樣的節日而寫的，故名名為《第十二夜》。